Synechococcus SP.PCC7942 glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enziminin ışıga bağlı düzenlenmesinde disülfit bağlarının rolünün araştırılması / Melike Öebi; Danışman Haydar Karakaya

Abstract

Bu çalışmada Synechococcus sp. PCC7942 glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PDH) enziminin ışığa bağlı düzenlenmesinde disülfit bağlarının rolünün araştırılması için in vitro enzim analizleri ve Äzwf mutant hücre elde edilmesi hedeflenmiştir. Öncelikle enzimin düzenlenmesinde disülfit bağlarının rolünün olup olmadığının anlaşılması hedeflendi. In vitro enzim analizleri için Synechococcus sp. PCC7942 hücrelerinden elde edilen süpernatantın DTT varlığında ve yokluğunda G6PDH aktivitesi gözlemlendi. Bunun için farklı DTT konsantrasyonlarında enzim aktivitesinin zamana bağlı olarak nasıl değişiklik gösterdiği takip edildi. Analizler sonucunda DTT'nin enzim aktivitesini etkilediği ve bu etkinin 50 mM konsantrasyonda 30 dk sonunda maksimuma ulaşarak %51.22'lik bir azalmaya neden olduğu belirlenmiştir. In vitro enzim analizleri sonucunda Synechococcus sp. PCC7942 G6PDH aktivitesinin DTT'den etkilendiğine ve dolayısıyla disülfit bağlarının enzimin ışığa bağlı düzenlenmesinde rolü olabileceği hipotezinin bu organizma için de geçerli olduğuna karar verildi. Synechococcus sp. PCC7942 zwf geni içinde yer alan iki sistein kodonunu değiştirmek üzere yürütülecek çalışmalarda gerekli bir Äzwf mutant elde etmek için çalışmalar yürütüldü. Öncelikle pUC18 klonlama vektörünün SphI bölgesi silinerek NruI ve SphI tanıma bölgesi taşımayan bir vektör (pUC181) elde edildi. Bu vektör içine 2.9 kb'lık Synechococcus sp. PCC7942 zwf fragmenti bağlanarak pSG11 vektörü elde edildi. Bu vektörün NruI/SphI kesimi ile iki adet sistein kodonunu da içeren zwf gen bölgesi vektörden uzaklaştırılabilecektir. Uzaklaştırılan bölgeye interpozon omega (W)'nın ligasyonu çalışmaları yürütüldü. Muhtemelen yapışkan SphI ucunun etkili olarak doldurulamaması nedeniyle kabul edilebilir bir sürede bu ligasyon gerçekleştirilemedi. Bu zorluğu aşmak üzere SphI tanıma bölgesinin yanına oligonükleotit-yönlendirilmiş mutasyon yöntemiyle ikinci bir NruI tanıma bölgesi eklenmesi stratejisi geliştirildi. Halen bu çalışmalar devam etmektedir.