Ters iyontoforez yöntemi ile homosistein molekülünün girişimsel olmayan amperometrik metotla tayin edilmesi

Abstract

Homosistein, kronik kalp rahatsızlıklarında kandaki düzeyi önemli bir gösterge olan, anlık tayini ve izlenmesi önem arz eden bir aminoasittir. Tez çalışmasında, homosisteinin, ters iyontoforez tekniği uygulanarak ve non-invaziv olarak, doku sıvısı ile birlikte deri dışına alınması ve alınan bu sıvıda, amperometrik homosistein biyosensörü kullanılarak tayin edilmesine hizmet eden giyilebilir bir biyosensör sisteminin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, tez çalışması üç aşamalı olarak yürütülmüş olup ilk aşamada, bir Screen Printed Karbon Elektrodun (SPCE) yüzeyi, kitosan, ferrosen ve karbon Nano Tüpün (CNT) belli oranlarını içeren bir karışımla modifiye edilmiştir. Bu yüzeye, Daminoasit oksidaz enziminin gluteraldehit ile immobilizasyonu sağlanarak amperometrik homosistein biyosensör geliştirilmiş olup, kalibrasyon aralığı 3-100, tayin limiti (LOQ) 2,184 µM olarak tespit edilmiştir. Literatürdeki örneklerine göre performansı başarılı olup tek kullanım için uygundur. Amperometik homosistein biyosensörün doğruluk testi insan serum örneği kullanılarak yapılmış olup elde edilen veriler HPLC sonuçları ile karşılaştırılmıştır. İkinci aşamada, deri yüzeyinden doku sıvısının dışarıya alınmasını simüle eden bir ters iyontoforez hücresi hazırlanmıştır. Ayırıcı membran olarak selüloz ester kullanılmıştır. Farklı homosistein konsantrasyonlarında, uygulanan akım yoğunluğu ve iyontoforez süresinin optimizasyonu yapılarak aralarındaki ilişki ortaya konulmuştur. Elde edilen verilerin literatür ile uyumlu olduğu gözlenmiştir. Son aşamada, optimize edilen ters iyontoforez şartlarında, homosisteinin ekstraksiyonu gerçekleştirilmiş ve elde edilen ektraktların amperometik homosistein biyosersörü kullanılarak damlatma yöntemiyle tayini gerçekleştirilmiştir. Vücuttaki homosisteini simüle eden 15-100 µM aralığında farklı konsantrasyona sahip standart çözeltilerin, 30 µM’ın altındaki değerlerinden ekstrakte edilen homosistein miktarları biyosensörün tayin limitinin altında kaldığı için analiz edilememiştir. 30 µM’dan daha yüksek konsantrasyona sahip standart çözeltilerinden elde edilen ekstraktlardaki homosisteinin ise, amperometirk homosistein biyosensörün çalışma aralığına denk geldiği gözlenmiş ve başarı ile tayini gerçekleştirilmiştir.

Homocysteine is an amino acid whose level in the blood is an important indicator in chronic heart diseases, and its instantaneous determination and monitoring are important. In this thesis study, it was aimed to develop a wearable non-invasive biosensor system that extracts homocysteine out of the skin with interstitial fluid via reverse iontophoresis technique and detects homocysteine in this interstitial fluid using an amperometric homocysteine biosensor. For this purpose, the thesis study was carried out in three phases. In the first phase, the surface of an Screen Printed Carbon Electrode (SPCE) was modified with a blend containing certain proportions of chitosan, ferrocene and Carbon Nano Tube (CNT). On this surface, an amperometric homocysteine biosensor was developed by immobilizing the D-aminoasit oxidase enzyme with glutaraldehyde. The calibration range was determined as 3-100 µM, limit of quantification (LOQ) 2.184 µM. Its performance was successful comparing with the examples in the literature, and it is suitable for single use. The accuracy test of the amperometric homocysteine biosensor was performed using a human serum sample, and the obtained biosensor data were compared with the HPLC results. In the second phase, a reverse iontophoresis cell was prepared that simulates the extraction of interstitial fluid from the skin surface. Cellulose ester was used as the separating membrane. At different homocysteine concentrations, the applied current density and the iontophoresis time were optimized and the relationship between them was revealed. It was observed that the obtained data was compatible with the literature. In the last stage, homocysteine was extracted under optimized reverse iontophoresis conditions and the obtained extracts were determined by drop method with amperometirc homocysteine biosensor. Standard solutions with different concentrations in the range of 15-100 µM, simulating homocysteine in the body, was tested with the developed system. It was determined that the amounts extracted at values below 30 µM was below the LOQ value of the biosensor. It was observed that the extracts obtained from the standard solutions with a concentration higher than 30 µM were successfully determined by remaining above the LOQ level of the developed biosensor and corresponding to the working range.