Pseudomonas aeruginosa'da piyoverdin üretimini engelleyen bir inhibitörün moleküler hedefinin belirlenmesi

Abstract

Bakterilerin birçok antibiyotiğe karşı direnç kazanmış olmaları, meydana getirdikleri enfeksiyonlar ile mücadelede önemli bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu nedenle günümüzde kullanılan geleneksel antibiyotikler yerine, etki mekanizmaları farklı yeni nesil ilaçların keşfi büyük önem taşımaktadır. Virülans, patojen mikroorganizmaların bulunduğu konağa zarar verebilme kapasitesi olarak tanımlanır. Toksin üretimi, çoğunluk algılanması (quorum sensing) ve biyofilm mikroorganizmaların virülans mekanizmaları arasında sayılabilir. Bu mekanizmalara karşı üretilen ilaçlar ise antivirülans ilaçlar olarak adlandırılır. Geleneksel antibiyotikler ile kıyaslandığında antivirülans ilaçlar, bakteri üzerinde evrimsel baskı oluşturmamakta ve direnç meydana getirmemektedir. Antivirülans ilaçlar ile terapi bakterileri öldürmeden veya gelişimlerini durdurmadan, sadece onların virülans özelliklerini inhibe etmeyi amaçlayan bir yöntemdir. Aynı zamanda yararlı mikrobiyotayı korumak ve antibiyotik kullanımı azaltmak bu terapinin temel amaçları arasındadır. Bu avantajlarından dolayı virülans mekanizmaların inhibe edilerek hastalıklar ile mücadele edilmesi; yeni ve güvenli bir yol olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu bilgilere dayanarak bu tezde, fırsatçı patojen Pseudomonas aeruginosa'nın patojen özelliğini oluşturan en önemli virülans faktörlerden piyoverdin üretimini engellediği tespit edilen piperidinkarboksiamid türevi bir molekülün, moleküler hedefi belirlenmiştir. Piperidinkarboksiamid türevi inhibitör maddenin moleküler hedefi çoğu laboratuvar tarafından kolayca benimsenen, inhibitör madde üzerinde herhangi bir modifikasyona ihtiyaç duymadan doğal hali ile çalışılmasına imkan veren, Pai ve ark. tarafından açıklanmış DARTS yöntemi ile belirlenmiştir. Bu yöntem temel olarak inhibitör madde ile etkileşime giren proteinlerin proteazlardan korunacağına prensibine dayanmaktadır.Yapılan çalışmalar sonucunda, kontrol grubu ile karşılaştırılan inhibitör madde uygulanmış protein örneklerinde 0,25 mg/ml Termolizin enzimi uygulamasının 2. dakikasında proteazdan korunmuş bir bant gözlemlenmiştir. QTOF-MS sisteminde analiz edilen korunmuş bant içinde kontrolden farklı 7 adet protein varlığı tespit edilmiştir. Analiz sonucunda virülansa etkili olduğu düşünülen proteinlerin yüksek değer verdiği görülmüştür. Piyoverdin üretiminde görevli Aspartat aminotransferaz proteinin ise en yüksek değere sahip olduğu bulunmuş ve böylece piperidinkarboksiamid türevi inhibitör molekülümüzün moleküler hedefi Aspartat aminotransferaz proteini olabileceği sonucuna varılmıştır.

The fact that bacteria have gained resistance to many antibiotics is a significant problem in the fight against the infections they cause. For this reason, instead of the traditional antibiotics the discovery of new generation drugs with different mechanisms of action is of great importance. Virulence is defined as the capacity of pathogenic microorganisms to harm the host. Toxin production, quorum sensing and biofilm targeting the host can be counted among the virulence mechanisms of microorganisms. Drugs produced against these mechanisms are called antivirulence drugs. Compared with traditional antibiotics, antivirulence drugs do not directlycause resistance and selective pressure on bacteria. Antivirulence therapy is a method that just aims to inhibit the virulence properties of bacteria without killing them or effecting their growth. At the same time, protecting the beneficial microbiota and reducing the use of antibiotics are among the main goals of this therapy. Because of these advantages, fighting diseases by inhibiting virulence mechanisms emerges as a new and safe way. Based on this information, in this thesis, the molecular target on the virulence mechanism of Pseudomonas aeruginosa of a piperidinecarboxyamide-derived molecule, which was found to inhibit the production of pyoverdin, one of the most important virulence factors forming the pathogenic feature of the opportunistic pathogen P. aeruginosa, has been determined. The molecular target of the piperidinecarboxyamide derivative inhibitor material is determined by the DARTS method explained by Pai et al., which is easily adopted by most laboratories and allows working in its natural state without the need for any modification on the inhibitory substance. This method is based on the principle that proteins interacting with the inhibitory substance would be protected from proteases. As a result of the studies conducted, a band protected from protease was observed in the second minute of 0.25 mg/ml Thermolysin enzyme test in inhibitory substance treated protein samples compared with the control group. The presence of 7 different proteins from the control were detected on the conserved band analyzed in the QTOF-MS system. As a result of the analysis, it was seen that the proteins thought to be effective on virulence gave high scores. Aspartate aminotransferase protein, which is involved in the production of pyoverdin, was found to have the highest score, and thus, it was concluded that the molecular target of our piperidinecarboxyamide derivative inhibitor molecule could be Aspartate aminotransferase protein.